一：進入無菌室步驟
1、進入無菌室前應打開紫光燈進行滅菌，時間為0。5—1小時。
2、關(guān)燈后0•5小時后放可進入。
3、進入更衣間更換衣服，佩帶口罩、帽子、鞋套。
二：實驗步驟
1、進入無菌室后，先把酒精燈點燃，然后在用酒精棉進行手部消毒。（酒精棉是用75%的酒精加入脫脂棉中制成）。
2、準備雙料管3根，單料管6根，培養(yǎng)皿7個。
3、直接從原液中吸取10ml放入雙料管，（3根每根各10ml）。
4、再吸取原液1ml放入單料管中（3根每根各1ml）。
5、再吸取原液1ml放入培養(yǎng)皿中（2個培養(yǎng)皿各1ml）。
6、再吸取原液1ml放入鹽水管中制成－1梯度的樣液 。
7、更換一根吸管，從－1梯度的樣液吸取1ml樣液放入單料管中（3根每根各1ml）
8、再吸?。?梯度樣液1ml放入培養(yǎng)皿中（2個培養(yǎng)皿各1ml）
9、再把每個培養(yǎng)皿中到入營養(yǎng)瓊脂平鋪底部搖允（注另作3個培養(yǎng)皿：空氣空白，把培養(yǎng)皿打開十分鐘倒入營養(yǎng)瓊脂平鋪底部搖勻。瓊脂空白，把培養(yǎng)皿中倒入營養(yǎng)瓊脂平鋪底部搖勻。鹽水空白，吸1ml生理鹽水放入培養(yǎng)皿中，倒入營養(yǎng)瓊脂平鋪底部搖勻）。
10、把全部作好的放入培養(yǎng)箱中，溫度36C＋－1×C，大腸24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培養(yǎng)皿中的瓊脂凝固后反轉(zhuǎn)過來放入培養(yǎng)箱中）
11、梯度：－1梯度為1ml原液加入9ml生理鹽水配成－2梯度為1ml－1梯度樣液加入9ml生理鹽水配成－3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一樣。
12、如果大腸初發(fā)酵產(chǎn)生氣泡，用接種筆沾一個產(chǎn)氣的液在伊紅美蘭平板上畫之字形然后放入培養(yǎng)箱中36C，24H＋－2H 。（接種筆在每次使用前必須在酒精燈上消毒。所畫之形不能劃破伊紅美蘭瓊脂表面）。
13、取出后在用接種筆在伊紅美蘭平板之字形上挑菌，放入乳糖復發(fā)酵管中 ，然后再培養(yǎng)36C＋－1C，24H＋＋－2H。
14、再在伊紅美蘭平板之字形上挑菌，放到載玻片上作鏡檢。（方法見標準）。
15、只有鏡檢成紫紅色和乳糖復發(fā)酵管產(chǎn)氣同時成立的情況下，才能斷定這根管是不合格。
16、清洗消毒這根試管前必須進行消毒霉菌，121C，0。5小時同時不能放氣。
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